آنالیز توسط میکروسکوپ نوری (OM)

آنالیز میکروسکوپ نوری

مقدمه

میکروسکوپ ها در ابتدا به عنوان وسیله ای برای دیدن اجسام کوجک ساخته شده بودند ولی در عصر حاضر از آن ها برای بررسی ویژگی های ریزساختاری مواد نیز استفاده می شود. امروزه میکروسکوپ های نوری به طور گسترده ای برای مشاهده نمونه های زیستی، برش بافت های سلولی، مقطع نازک سنگ ها، ذرات خاک و ماسه، سطح صیقلی فلزات و سرامیک ها و نیز رنگدانه ها مورد استفاده قرار می گیرند. از این رو این میکروسکوپ فقط وسیله ای برای دستیابی به بزرگنمایی بیشتر نیست، بلکه متداول ترین وسیله برای آنالیز و شناسایی مواد به شمار می رود. در این مقاله ابتدا مفاهیم بنیادی و سپس انواع و ساختمان میکروسکوپ نوری معرفی می شوند. در پایان نیز به کاربردهای آن اشاره خواهد شد.

مفاهیم پایه ای

• اصل هویگنس و پرتوی همدوس (Huygens Principles)

از نظر فیزیکی یک پرتو بازتابیده از سطح جسم دارای چهار نوع ویژگی است: دامنه، طول موج، فاز و قطبش. چشم انسان می تواند دامنه را به صورت درخشندگی و طول موج را به شکل رنگ دریافت کند، اما پرتو های نوری به سبب طبیعت موجی خود دارای فاز و صفحه ارتعاش یا درجه قطبش ویژه ای هستند. برای درک مفهوم پراش نور، توجه به اصل هویگنس ضروری است. در این اصل، نور به صورت جبهه های موجی منتشر می شود که بر راستای انتشارشان عمودند. اگر قله های دو موج نور بر یکدیگر مطبق شوند، همدیگر را تقویت کرده و به صورت درخشنده دیده می شوند و اگر قله یکی بر دره دیگری مطبق شود، همدیگر را حذف کرده و تاریکی پدید می آید. این حالت همان همدوسی نور است؛ حالتی که ارتعاش همه‌ی پرتوها هم فاز است.

• قطبیدگی یا پلاریزاسیون (Polarization)

نوری که به‌طور طبیعی از یک منبع نوری (مانند خورشید) و بدون گذر از محیط مادی تابیده می شود، نور ناقطبیده است. قطبش یا پلاریزاسیون از ویژگی‌های اساسی است که راستای نوسان موج نوری را در صفحه‌ی عمود بر جهت انتشار آن نشان می‌دهد. حال اگر تمامی امواج در یک جهت قطبیده شوند، پلاریزه شده و دارای قطبیدگی یکسانی می گردند. قطبش نور در طبیعت و زندگی روزمره، بسیار به چشم می‌خورد. مثلا قطبش نور، اساس کار نمایشگرهای کریستال مایع یا همان ال سی دی است. مواد کریستال مایع، دارای این ویژگی هستند که با اعمال ولتاژ، می‌توانند قطبش نور عبور کننده از خود را تغییر دهند.

• پراش نور (Light Diffraction)

در میکروسکوپ های نوری پراش پدیده ‌ایست که هنگام برخورد موج با یک مانع یا شکاف که به صورت خمش موج دور گوشه‌های شکاف و انتشار آن به درون ناحیه سایه مانع تعریف می‌شود. این پدیده موجب می‌شود تا موج نوری خودش را ترمیم کرده و امکان دریافت موج هنگامی که مانعی میان منبع و دریافت‌کننده است، فراهم شود. تشکیل تصویر یک جسم به کمک میکروسکوپ نوری مانند آن است که جسم را مجموعه ای از نقاط پراش یافته‌ی ساده تصور کرد. فرایند فیزیکی که سبب تشکیل تصویر می شود، تداخل پرتوهای پراشیده است که از عدسی شیئی میکروسکوپ عبور می کند.

• حد تفکیک (Resolution)

توان تفکیکی یا حد تفکیک یک عدسی، توانایی جداسازی جزئیات یک جسم را در تشکیل تصویر نشان می دهد. در واقع، کوچک ترین فاصله بین دو نقطه از یک جسم را که می توان در تشکیل تصویر از یکدیگر جدا کرد، توان تفکیک نام دارد. توان تفکیک یک میکروسکوپ نوری به دلیل پدید آمدن پراش از دهانه آن محدود می شود. برای تفکیک دو نقطه از یک جسم، دست کم به دو دسته پرتو ورودی مستقیم و پرتو پراشیده درجه اول آن جسم نیاز است که باید توسط عدسی شیئی عبور داده شود.

• دایره های آیری (Airy Disks)

پس از آنکه پرتو های گسیل یافته از نقاط گوناگون یک جسم، از عدسی شیئی عبور می کند و تصویر پدید می آید، نقطه های گوناگون تصویر، به صورت نقش ها یا طرح های کوچکی دیده می شوند. این پدیده به دلیل پراش نور به هنگام عبور از دهانه دایره ای شکل عدسی رخ می دهد. هر یک از این نقش ها و طرح ها، شامل دایره های روشن و تاریک هم مرکز هستند. این دوایر، دایره های آیری نام دارند. هرچه دایره های آیری پدید آمده کوچکتر باشند، جزئیات بیشتری از نمونه قابل مشاهده و تشخیص خواهد بود. توان تفکیک یک میکروسکوپ نوری در جداسازی دو نقطه نزدیک، به هم پوشی دایره های آیری آن بستگی دارد.

ساختمان میکروسکوپ نوری

بسته به نوع کاربرد میکروسکوپ نوری، در آن از انواع عدسی ها، صافی ها، قطبشگر ها و نیز دستگاه های کمکی برای مشاهده و ثبت تصویر استفاده می شود. بسیاری از میکروسکوپ های نوری جدید به دوربین های CCD، کارت رابط الکترونیکی و پردازشگر رایانه مجهز هستند. فناوری های جدید الکترونیکی، امکان استفاده از بسته های نرم افزاری گوناگونی را نیز فراهم کرده است. به این ترتیب می توان به کمک آن ها و سخت افزارهای مناسب، اندازه گیری های دقیق، محاسبات آماری و حتی مقایسه ریزساختار مواد را با داده های موجود در بانک اطلاعاتی انجام داد و نسبت به شناسایی مواد و فازها به کمک نرم افزارهای پزدازشگر تصویری اقدام کرد. اجزای میکروسکوپ نوری به دو بخش مکانیکی و نوری تقسیم می شوند.

به طور کلی قسمت‌ های مهم “بخش نوری” عبارنتد از:

• عدسی چشمی: این عدسی برای مطالعه و مشاهده تصویر است.
• عدسی شیئی: این عدسی تصویری بزرگتر از جسم، حقیقی و وارونه ایجاد می کند و شامل چهار عدسی زیر است:

عدسی شماره ۴ (عدسی کوچک)
عدسی شماره ۱۰ (عدسی خشک)
عدسی شماره ۴۰ (عدسی خشک)
عدسی شماره ۱۰۰ (عدسی روغنی)

• کندانسور: کندانسور نور را جمع کرده و آن را به‌طور مستقیم روی نمونه هدایت می‌کند.
• دیافراگم: مقدار نور ورودی را کم و زیاد می‌کند.
• ماکرومتر: ماکرومتر صفحه میکروسکوپ را بالا و پایین برده و برای پیدا کردن تصویر نمونه به کار می‌رود.
• میکرومتر: تصویر تنظیم شده را واضح تر کرده و آن را برای مشاهده مشخص تر می‌کند.

بین عدسی شیئی (عدسی ۱۰۰) و نمونه فاصله ‌ای در حدود ۱/۸mm وجود دارد که این فاصله را فاصله کانونی گویند. معمولا با روغن این فاصله را پر می‌کنند. در غیر این صورت به علت وجود هوا و شکست نور عبوری از نمونه، تصویر ناواضح خواهد بود.

بخش “مکانیکی” میکروسکوپ نوری نیز شامل قسمت‌ هاییست که مستقیما در عبور و تشکیل تصویر نقشی به عهده ندارند و شامل کلیه بخش ‌های نگهدارنده، حرکت دهنده و ثابت‌کننده یک میکروسکوپ نوری است، مانند:

• پایه: معمولا به اَشکال نعلی، مدور، مکعب مستطیلی و مانند آن ساخته می‌ شود. جنس پایه معمولا از “فولاد سنگین” انتخاب می‌ گردد تا در زمان مطالعات میکروسکوپی و عکس‌ برداری از هر گونه لغزشی جلوگیری شود.
• بازو: برای جابجایی میکروسکوپ به کار می‌رود.
• صفحه میکروسکوپ: صفحه‌ای است فلزی یا کائوچویی که محل قرار دادن جسم مورد مطالعه است. نور از منفذ تعبیه شده در وسط صفحه پالتین عبور کرده و به نمونه مورد مطالعه می‌رسد.
• صفحه گردان یا متحرک: قطعه ای فلزی است تقریباً به شکل مخروط ناقص که در سطح پایین آن تعدادی سوراخ تعبیه شده‌ است. به هر یک از این سوراخ‌ها، یک لوله عدسی شیئی پیچ می‌شود. با چرخاندن صفحه گردان، عدسی شیئی مورد نیاز در میدان دید قرار می‌گیرد.
• پیچ‌های تنظیم ماکرومتر (سریع) و میکرومتر (دقیق): شامل پیچ تنظیم سریع یا ماکرومتر و پیچ تنظیم دقیق یا میکرومتر است که بر روی دسته میکروسکوپ قرار دارند.
• سیستم ورنیه: از دو قسمت خط‌ کش مانند درست شده ‌است که طول و عرض مختصاتی نمونه را مشخص می‌کند و می توان با یادداشت کردن این دو عدد پس از جابه جاشدن نمونه دوباره نقطه مورد نظر را به راحتی پیدا نمود.

در شکل زیر قسمت های مهم میکروسکوپ نوری روی شکل نشان داده شده است.

انواع میکروسکوپ نوری

دو دسته اصلی میکروسکوپ نوری وجود دارد که عبارتند از میکروسکوپ ساده و مرکب. میکروسکوپ ساده میکروسکوپی است که از یک عدسی یا ترکیب به هم چسبیده عدسی ‌ها برای بزرگنمایی استفاده می‌کند. معروف ترین نوع میکروسکوپ ساده، ذره بین است که برای بزرگنمایی های کم استفاده می شود. درحالی که میکروسکوپ مرکب از چندین عدسی برای بزرگنمایی استفاده می‌کند. در این بخش به تعدادی از مهم ترین این میکروسکوپ ها اساره می کنیم:

استریوسکوپ: یک نوع میکروسکوپ چشمی است که برای مشاهده نمونه تحت بزرگنمایی اندک، معمولاً با استفاده از نور منعکس شده از منبع شیء تا انتقال نور از میان آن، استفاده می‌شود. این دستگاه از دو مسیر چشمی متفاوت با دو عدسی چشمی و شیئی استفاده می‌کند تا زوایای مشاهده اندکی متفاوت برای چشم‌های چپ و راست فراهم شود.

میکروسکوپ فلورسانس: انواع خاصی از میکروسکوپ نوری که منبع نور آن پرتو های فرابنفش است. برای مشاهده نمونه زیر این میکروسکوپ‌ها بخش‌ها یا مولکول‌های ویژه داخل سلول با مواد فلورسانس یا نورافشان رنگ آمیزی می‌شوند. مواد فلوئورسانس نور را در طول موج فرابنفش جذب می کنند و در طول موج بلندتری در طیف مرئی تابش می کنند. تصویر نهایی حاصل از نور تابش شده از نمونه است.

میکروسکوپ اختلاف فاز: یکی از کاربردهای مهم این میکروسکوپ، مشاهده‌ی سلول های زنده با جزئیات بالاست. ساختمان نمونه‌ی قرار گرفته در زیر میکروسکوپ به گونه ای است که اجزای مختلف، جذب نور متفاوتی دارند. در نتیجه نور عبور کرده از قسمت های مختلف، شدت های متفاوتی دارند. تصویر نهایی از اختلاف شدت نور عبور کرده از جسم تشکیل می شود.

میکروسوپ پلاریزان: در این میکروسکوپ ها از نور پلاریزه شده برای دیدن نمونه ها استفاده می شود. این نوع از میکروسکوپ ها برای مطالعه‌ی موادی با ضریب شکست بالا مانند کریستال ها مناسب هستند. از این نوع میکروسکوپ ها برای مطالعه‌ی خواص نوری بلورها، کانی ها و سنگ های معدنی استفاده می شود.

میکروسکوپ دیجیتال: این میکروسکوپ مجهز به یک دوربین دیجیتالی است که می تواند تصاویر دریافتی را بر روی رایانه و موبایل نشان دهد. با میکروسکوپ دیجیتال امکان آنالیز تصویر به دست آمده بیشتر می شود. مثلا می توان فاصله و مساحت را اندازه گرفت. این میکروسکوپ ها مانند یک وب کم با عدسی قدرتمند عمل می کنند. مزیت آن ها، قیمت کم و قابلیت جابجایی آن هاست.

روش آنالیز با میکروسکوپ نوری

در ابتدا باید مراحل آماده سازی نمونه را انجام داد. سپس برای مشاهده یک نمونه میکروسکوپی باید ابتدا میکروسکوپ نوری را طوری روی میز قرار داد که بازوی آن به سمت محقق و صفحه آن به سمت مقابل باشد. در اولین گام، صفحه گردان عدسی های شیئی را باید چرخاند تا ضعیف ترین عدسی در امتداد عدسی چشمی قرار گیرد. حال از طریق منفذ چشمی، میزان نور را توسط دیافراگم به نحوی تنظیم کرد که نور مناسب شود ولی زیاد و زننده نباشد. در این مرحله لازم است نمونه میکروسکوپی در زیر گیره های مخصوص لام قرار گیرد و پیچ تنظیم را آن قدر چرخاند تا عدسی چشمی ضعیف در فاصله ۱ سانتی متری نمونه بایستد.

حال از درون چشمی میکروسکوپ نگاه کرده تا با چرخش پیچ تنظیم وضوح تصویر حاصل شود. برای تنظیم میکروسکوپ و واضح شدن تصویر می توان از پیچ تنظیم دقیق نیز استفاده کرد. در صورتی که محقق تمایل داشته باشد بزرگنمایی بیشتر شود، لازم است ابتدا توسط پیچ تنظیم، فاصله عدسی شیئی را با نمونه میکروسکوپی افزایش داده و سپس عدسی شیئی را چرخاند و عدسی قوی تر را در امتداد عدسی چشمی قرار داد. پس از آن مجدداً میکروسکوپ را تنظیم کرد. توجه شود که هیچ گاه نباید عدسی شیئی با نمونه میکروسکوپی تماس پیدا کند. همواره لازم است عدسی ها با پارچه های مخصوص لنز تمیز شوند. برای مشاهده اجسام در زیر میکروسکوپ نیز همیشه باید از ضعیف ترین عدسی شروع کرده و به سمت عدسی های قوی تر رفت.

تشکیل تصویر در میکروسکوپ

تشکیل تصویر در میکروسکوپ از قوانین تشکیل تصویر در عدسی های محدب پیروی می کند. پس از بازتاب نور از جسم، تصویری از جسم توسط عدسی شیئی تهیه می شود. این تصویر حقیقی، معکوس و بزرگتر از جسم است. تصویر ایجاد شده توسط عدسی شیئی، در فاصله‌ی کانونی عدسی چشمی قرار می گیرد. در نهایت عدسی چشمی همانند ذره بین، از این تصویر تصویر نهایی ایجاد می کند که مجازی، بزرگتر و مستقیم است که با چشم رویت می شود.

به طور تخصصی تر، قطبیده کردن امواج نوری و پلاریزاسیون در کنار عملیات همدوس نمودن پرتوها در میکروسکوپ های نوری انجام می گیرد. چرا که در غیر این صورت هیچ تصویری به وجود نخواهد آمد. امروزه به طور کلی، اساس میکروسکوپ های نوری، عبور نور با طول موج های مختلف از چند عدسی محدب است. حال هرچه این طول موج کوتاه تر باشد، قدرت میکروسکوپ نوری بیشتر خواهد بود. یک میکروسکوپ نوری مدرن حداکثر تا ۲۰۰۰ برابر بزرگنمایی دارد. توان تفکیک یک میکروسکوپ نوری نیز فقط به کیفیت و تعداد لنزهای آن بستگی ندارد، بلکه به طول موج نور مرتبط است.

کاربردهای نوین میکروسکوپ نوری

میکروسکوپ نوری به طور گسترده در میکرو الکترونیک، نانوفیزیک، بیوتکنولوژی، داروسازی، مهندسی معدن، میکروبیولوژی و مهندسی مواد مورد استفاده قرار می‌گیرد. امروزه همگام با کاربردهای صنعتی، میکروسکوپ نوری در روند تشخیص های پزشکی نیز به طور گسترده مورد استفاده قرار می‌گیرد. طبیعتا این میکروسکوپ با روند رو به رشد علم، دستخوش تغییرات زیادی شده است. مهم ترین کاربرد های نوین میکروسکوپ نوری شامل موارد زیر می شود:

• بهبود کنتراست فازی: میکروسکوپ نوری می‌تواند برای فراهم آوردن اطلاعات مربوط به فعالیت سلول ‌ها و نانو ساختارهای سطحی مورد استفاده قرار گیرد. چرا که آداپتورهای متفاوت این میکروسکوپ می‌تواند سبب بهبود تصاویر و افزایش کنتراست فازی شود. در تکنولوژی های نوین، تصویر سه‌ بعدی حاصل از این میکروسکوپ، با رزولوشن بالا می‌تواند برای مشاهده ارگانیسم‌ ها در طول یک دوره زمانی مورد استفاده قرار گیرد.
• آنالیز نمونه های غیر بازتابی: میکروسکوپ نوری فلورسانس یک تکنیک خوب برای مشاهده نمونه ‌هایی است که نور رنگی متفاوتی ساطع می‌کنند. این فرایند بسیاری از محدودیت های آنالیز ساختاری در مهندسی مواد را از میان برداشته است.
• آنالیز بدون عدسی: با پیشرفت در زمینه سنسورهای “سیماس” و باتری‌های CCD، سیستم ضبط تصاویر در میکروسکوپ نوری اخیرا دیجیتال شده است. اکنون میکروسکوپ‌های دیجیتالی هستند که تصویر یک نمونه را به‌طور مستقیم ضبط و بدون نیاز به عدسی بر روی صفحه رایانه نشان می‌دهند.
• متالوگرافی و محاسبات ریزساختاری: تحقیقات متالوگرافی همواره بر پایه‌ی میکروسکوپ های نوری استوار بوده است. مشاهده‌ی فازهای سطحی، تحلیل فصل های مشترک، نقص های سطحی و ناخالصی ها همه و همه به کمک این میکروسکوپ انجام می گیرد. با بهره گیری از اصول مقیاس بندی سطحی در بزرگنمایی های مختلف، اندازه گیری ابعاد دانه ها نیز امکان پذیر است.
• تکنولوژی زمینه روشن: قابلیت مشاهده‌ی “اجسام تاریک” با قابلیت صفر درصد جذب نور با این تکنولوژی میکروسکوپ نوری ممکن گردیده است. اینجا منبع نور در زیر نمونه قرار می‌گیرد. سپس نور از طریق نمونه منتشر می ‌شود و توسط عدسی شیئی و سنسوری که بالای نمونه قرار گرفته‌اند مشاهده می‌شود. هر چه نمونه تیره‌تر باشد، چگالی نور جذب شده بیشتر است.

منابع

• روش های شناسایی و آنالیز مواد – دکتر فرهاد گلستانی
• مقدمه ای بر روش های پیشرفته آنالیز مواد – دکتر مصطفی حاجیان