آنالیز MTT ؛ ساده، ارزان و مطمئن در علم بیوتکنولوژی

چه لزومی دارد که تست سمیت سلولی اجرا شود؟

قوانین بهداشتی حاکم بر جهان امروز، ایجاب می کنند که برای استفاده از هر ماده یا ابزار بهداشتی که با انسان تماس مستقیم دارد، تست سمیّت سلولی انجام شود. نداشتن سمیّت سلولی یکی از شروط اصلی ورود محصولات مختلف به بازار تجهیزات پزشکی است.

منظور از تست های سمیّت سلولی، آزمون هایی است که اثرات ناخواسته ترکیبات مختلف بر روی سلول را بررسی می کنند. این فرایندها در محیط بیرون از بدن انسان یا به اصطلاح برون تن انجام می گیرند. اکثر این فرایندها نیز از کشت سلولی استفاده می کنند.

در آنالیز MTT بر اساس استاندارد بین المللی ISO 10993-5 تجهیزات مختلف از لحاظ سمیت سلولی مورد آزمایش قرار می گیرند تا در صورتی که فاقد اثرات سمی باشند، استانداردها و مجوزهای لازم را کسب کرده و وارد بازار خرید و فروش شوند.

تست MTT چیست؟

تست MTT شناخته شده ترین تست برای بررسی میزان زنده ماندن سلول است. هدف اصلی این آزمون، بررسی اثر سمیت ترکیبات، داروها یا دیگر مکمل ها روی سلول است. البته ممکن است در مقالات با عنوان فرایندی برای بررسی تکثیر یا شمارش سلولی هم ذکر شود.

آنالیز MTT با تاثیر بر روی اندامک های درون سلولی، قادر است بین سلول زنده و مرده تمایز قائل شود. در این روش سلول ها پس از کِشت شدن در آزمایشگاه، با مواد مورد نظر به اصطلاح “تیمار” می شوند تا میزان سمیت آن ها ارزیابی شود.

در پایان این تست، برای هر غلظت از ماده، میزان زنده ماندن سلول ها مشخص می شود. با این که این روش در اصل برای محلول ها و ترکیبات محلول در آب است، ولی در حال حاضر برای دیگر ترکیبات حل شونده در حلال های آلی و نانوذرات هم اجرا می شود.  

پیش به سوی درک رفتار سلول ها!

اجرای آنالیز MTT کمک شایانی به درک رفتار سلول ها می کند. رفتار و سرعت تکثیر سلول ها ممکن است تحت تاثیر هورمون ها، فاکتورهای رشد، سایتوکاین ها و میتوژن ها افزایش داشته باشند یا اصلا تغییر نکنند. همین طور بعضی از داروها و مواد سایتوتوکسیک (سمی) مثل داروهای ضد سرطان، ممکن است باعث نکروز یا آپوپتوز  (مرگ و میر) سلول ‌ها یا کاهش سرعت تکثیر و رشد و یا حتی از بین رفتن ساختار سلولی شوند. با تحلیل درست تست MTT می توان بسیاری از این رفتارها را ارزیابی کرد.

پیش از شناخت MTT، میتوکندری را بشناسید!

اصل و اساس آنالیز MTT مبتنی بر فعالیت میتوکندری (جزئی از سلول) است. معمولا فعالیت های میتوکندری در سلول های زنده پایدار است. از این رو هر گونه تغییر در تعداد سلول های فعال و زنده، به صورت خطی با فعالیت میتوکندری مرتبط است.

با نگاهی دیگر (و البته علمی تر) هم می توان اصول تست MTT را بیان کرد. این آزمایش يک روش رنگ سنجی است که بر اساس احیا شدن و شکسته شدن کریستال های زرد رنگ «تترازولیوم» به وسیله آنزیم «سوکسینات» دهیدروژناز شده و تشکیل کریستال های بنفش رنگ نامحلول، آنالیز نهایی را انجام می دهد. (اگر از این اصطلاحات پیچیده سر درنیاورید، نگران نباشید! (چون در بخش های بعدی این مقاله، این تعاریف را با جزئیات برایتان توضیح خواهیم داد.)

در آنالیز MTT بر خلاف دیگر روش ها، مراحل شست و شو و جمع کردن سلول که معمولا باعث از بین رفتن بخشی از سلول ها و زیاد شدن خطای کار می شود، حذف شده است. یعنی تمام مراحل آزمایش از ابتدای کشت سلول تا خواندن و تحلیل نتایج با فوتومتر، به شکلی کاملا جمع و جور و در یک «میکرو پلیت» اجرا می شود. از این رو تکرار پذیری، دقت و حساسیت آزمایش بالاست.

9

دقیــقه مطالعه

اسپکتروفتومتری (طیف سنجی نوری)

اختراع اسپکتروفتومتر یا طیف سنج، انقلابی در عرصه شناخت خواص نوری مواد بوده است. ...

تشریح فرایند تست MTT

تترازولیوم، ماده ای جذاب برای سلول ها

ماده اصلی و ابتدایی این تست یعنی تترازولیوم (که قبلا نامش را آورده بودیم) به صورت پودری و معمولا محلول با ماده PBS به کار گرفته می شود. این محلول زرد رنگ، به شدت به نور حساس است. همچنین به علت دارا بودن بار مثبت خالص، جذب غشای سلول ها می شود. سپس از طریق فرایند اندوسیتوز «Endocytosis» وارد سلول ها شده و به میتوکندری می رود.

این ماده در میتوکندری توسط آنزیم «سوکسینات دهیدروژنازِ» میتوکندری، که فقط و فقط در زنجیرۀ تنفسیِ سلول زنده فعال است، به رسوب های بنفش غیر قابل حل در آب تبدیل می شود. نکتۀ جذاب ماجرا این جاست که از میان تعداد زیادی سلول که وجود دارد، فقط سلول های زنده می توانند محلول MTT را به یک رسوب «فرومازون» بنفش غیر محلول در آب تبدیل کنند.

تشخیص تفاوت شدت رنگ ها در تست MTT

تا این جای کار فهمیدیم اگر سلول های موجود در پلیت دستگاه زنده باشند، تحت تاثیر ماده MTT به رنگ بنفش در می آیند. اما چگونه باید تفاوت شدت رنگ را در پلیت ها از هم تشخیص داد؟

تراکم نوری محلول حاصل را می توان با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج ۵۷۹ نانومتر با طول موج مبنای ۶۳۰ نانومتر اندازه گیری کرد.

با توجه به این که واکنش احیای MTT به فرومازون تنها در سلول های زنده رخ می دهد و سلول های زنده نیز دارای آنزیم دهیدروژناز فعال هستند، پس مقدار عددی به دست آمده از این تکنیک به طور مستقیم با تعداد سلول های زنده در ارتباط است.

بنابراین در تست MTT میزان فرومازون تولید شده توسط سلول های تیمار شده را توسط تجهیزات یا دارویی خاص، با میزان فرمازون تولید شده توسط سلول های شاهد که دارویی دریافت نکرده اند مقایسه می کنند. از این مقایسه هم میزان اثر آن عامل خاص را روی مرگ و مهار رشد سلول ها تعیین می کنند.

بدیهی است که هر چه میزان جذب خوانده شده نسبت به حالت کنترل کمتر باشد، می توان نتیجه گرفت که تعداد سلول های زنده کم شده و مهار رشد بیشتری صورت گرفته است.

چگونه تست MTT را اجرا کنیم؟

حالا می خواهیم یاد بگیریم چطور باید این تست را انجام دهیم. این آزمایش دارای 3 مرحله اصلی شامل کشت سلولی (Seeding)، تیمار (Treatment) و در نهایت خود آنالیز MTT است. هر کدام از این مراحل معمولا یک روز زمان می برد. همچنین تعداد روز MTT بسته به نوع سلول و دارو، می تواند 24 ، 48 و یا 72 ساعت پس از روز Treatment باشد.

در صورتی که آنالیز روی سلول های در تماس با پلیت و به شکل پیوسته انجام شود، ابتدا باید تعداد مناسبی سلول را در هر یک از چاهک های دستگاه آنالیز MTT کشت داد. سپس اجازه داد در مدت 24 ساعت، سلول ها به کف پلیت بچسپند و به حالت پایدار دربیایند.

سپس چاهک های کنترل (Blank ,C+) و آزمایش را انتخاب می کنیم و مقدار مناسبی از ماده میتوژن یا داروی موردنظر را به چاهک های آزمایش اضافه می کنیم. پلیت را در زمان مطلوب درون آنکوباتور می گذاریم تا ماده مورد نظر روی سلول ها تاثیر کند.

پس از اتمام زمان انکوباسیون، محیط کشت را دور می ریزیم. به هر چاهک ۲۰۰ میکرولیتر محیط کشت حاوی نیم میلی گرم در میلی لیتر محلول MTT اضافه می کنیم و دوباره برای مدت ۲ تا ۴ ساعت در انکوباتور دی اکسیدکربن در ۳۷ درجۀ سلسیوس قرار می دهیم.

در انکوباسیون آنالیز MTT چه اتفاقی می افتد؟

در طی زمان انکوباسیون، مادۀ MTT توسط سیستم سوکسینات دهیدروژناز که گفتیم یکی از آنزیم های چرخۀ تنفسی میتوکندری ها است، احیا می شود. احیا و تجزیۀ این حلقه باعث تولید کریستال های بنفش رنگ فورمازون می شود که در زیر میکروسکوپ به راحتی قابل تشخیص هستند.

9

دقیــقه مطالعه

آنالیز توسط میکروسکوپ نوری (OM)

آنالیز میکروسکوپ نوری مقدمه میکروسکوپ ها در ابتدا به عنوان وسیله ای برای دیدن اج...

گفتیم که میزان رنگ تولید شده با تعداد سلول هایی که از نظر متابولیک فعال هستند (سلول های زنده)، رابطه مستقیم دارد. البته این نکته مهم را نگفتیم که کریستال های فورمازون در آب غیر محلول هستند و باید قبل از رنگ سنجی با مادۀ حلالی مثل دی متیل سولفوکساید (DMSO) به حالت محلول دربیایند.

تجهیزات آنالیز MTT

ابزار کاربردی اصلی در آنالیز MTT دستگاه الایزا ریدر (Eliza Reader) است که آن را اجمالا معرفی خواهیم کرد. دیگر اجزای معمول این آزمایش، ابزارهای کشت سلول اند که مهم ترین آن ها عبارتند از:

• هود آزمایشگاهی کلاس II: دارای فیلتر لامینار در بالا و لامپ پرتوی فرابنفش برای استریل کردن هود
• انکوباتور CO₂: رطوبت 95 درصد، دمای 37 درجۀ سلسیوس و دی اکسید کربن 5 درصد
• اتوکلاو: استریل سازی ظروف شیشه ‌ای
• بن ماری: برای گرم کردن محیط کشت و باز کردن نمونه فریز شده
• میکروسکوپ نوری invert: مشاهدۀ سلول‌ ها در فلاسک
• سانتریفیوژ: برای جداسازی سلول ‌ها

9

دقیــقه مطالعه

ظروف آزمایشگاهی

بدون شک لازمه‌ی انجام هر آزمایش بهره‌مندی از مواد اولیه با کیفیت و ظروف آزمایشگا...

دستگاه Eliza Reader تست MTT

دستگاه الایزا ریدر (Eliza Reader) نوعی خوانشگر ميكروپليت است. این اسپكتروفتومتر برای خواندن نتايج آزمايش MTT طراحی شده است. در این دستگاه حضور هر گونه آنتی بادی يا آنتی ژن در نمونه به طور مستقيم و يا به وسيله نشان دار ثانويه در روی سطح جامد تعيين می شود. در نهايت، میزان جذب محصول واكنش ايجاد شده با اسپكتروفتومتر این دستگاه خوانده می شود.

آزمون MTT چقدر قابل اعتماد است؟

در یک کلام باید بگوییم این روش آنالیز یکی از قابل اطمینان ترین روش ها در بیوتکنولوژی است. موضوع قابل توجه که باعث شده ترکیب MTT یک فاکتور مناسب برای بررسی زنده ماندن (Viability) در سلول ها باشد، قابلیت تمییز دادن دقیق بین سلول های زنده و مرده است.

به علاوه، این ماده در محدوده خاصی از طول موج جذب نوری دارد. بنابراین می تواند روش بسیار ظریفی برای بررسی فعالیت سلول ها باشد. البته از حق نگذریم، بعضی مواقع ترکیب MTT با ماده ای که برای بررسی سمیت آزمایش می شود، تداخل هایی دارد. این تداخل ها باعث اختلال در نتیجۀ تست MTT می شوند.

در این مواقع ترکیباتی مانند LDH، XTT و “رِزازورین” (Resazurin) جایگزین های مناسبی برای اجرای تست MTT هستند. البته باید دقت داشت هر یک از این مواد شرایط خاص خود را دارند و جذب نوری متفاوتی خواهند داشت که باید در تحلیل نتایج آن ها را در نظر بگیریم.

بررسی نتایج آزمایش MTT

به زبان ساده اگر بین گروه سلولیِ کنترل و تیمار، تفاوت معناداری از نظر رشد سلول ها مشاهده نشود، می توان نتیجه گرفت که وسیلۀ مورد نظر سمیت سلولی ندارد. اما اگر در سلول های تیمار اولیه، شاهد کاهش چشمگیری از حیات سلولی باشیم، می توان نتیجه گرفت وسیلۀ مورد آزمایش دارای سمیت سلولی است.

اکثر تست های سنجش زنده مانی مانند آزمایش MTT به این صورت هستند که پس از خوانش پلیت با دستگاه الایزاریدر، از جذب خانه های تکرار شده برای هر دُز (doze) میانگین گرفته می شود. باید توجه داشت که میزان جذب هر چاهک از میزان جذب چاهک بلانک کم شود.  البته این کار را خود دستگاه الایزا ریدر انجام می دهد.

در نهایت میانگین جذب هر دز به میزان جذب کنترل تقسیم شده و در 100 ضرب می شود. اعداد حاصل نشان دهندۀ درصد نرخ زنده مانی یا همان Viability هستند. سپس نرخ زنده مانی هر یک از غلظت ها به شکل نمودار ترسیم شده و بر اساس نمودار، تفسیر و آنالیز نتایج اجرا می شود.

کاربردهای آنالیز MTT

اکثر قریب به اتفاق افرادی که در آزمایشگاه های سلولی کار یا پژوهش می کنند، با این دستگاه سر و کار دارند. علاوه بر این، پژوهشگرانی که با داروها کار می کنند نیز گذرشان به تست MTT خواهد خورد.

در آزمايشگاه های دانشگاه های ايران، آنالیز MTT رايج ترين و پركاربردترين تست در بین تكنيک های سلولی به شمار می رود. دانشجویانی که علاقمند به پروژه های دارویی و سلولی هستند، بايد به اجرا و تحلیل نتایج اين تكنيک مسلط باشند.

کاربرد اصلی این تست اندازه گیری میزان تکثیر سلول ها در مواجه با عوامل مختلف و تعیین میزان سمیت این عوامل است، هنگامی که این عوامل بر روی سلول ها اثر دارند. آزمایش MTT از روش های کلورومتریک است که با دقت زیادی مرگ سلولی را تخمین زده و قادر است مرگ سلول را در مراحل خیلی دیر «آپاپتوسیس» وقتی که متابولیسم سلولی در حال افت است، تشخیص دهد.

آزمون MTT از سوی اکثر متخصصین زیستی برای دستیابی به درصد زنده مانی (Viability) تحت تأثیر داروها و مواد مختلف توصیه می شود. این آزمون در اوج سادگی، دستیابی سریع به میزان سمیت مواد و به دست آوردن IC50 را امکان پذیر کرده است. (IC50 به معنای غلظتی است که در آن نصف سلول ها می میرند.)

نكات كليدی در اجرای آزمون MTT

• حتما در انجام تست باید دقت و تمرکز کافی چاشنی کار شود و محاسبات نیز دقیق انجام شود.
• درون چاهک های پلیت دستگاه، باید تعداد محدود و مشخصی سلول کشت شود و از حد مجاز نباید کمتر یا بیشتر باشد.
• تعداد سلول ها درون هر چاهک باید بین 103 تا 105 سلول باشد.
• شمارش صحيح سلول ها برای هر چاهک امری به شدت حیاتی و ضروری است.
• بهتر است محلول سلولی یکنواخت و همگن باشد تا تراكم سلول ها در هر چاهک يكسان بماند و تاثير دارو روی جمعيت سلولی دقيق تر مشخص شود.
• برای هر ردۀ سلولی حداقل سه بار آزمايش را تكرار كنيد تا احتمال وقوع خطا كاهش پيدا کند.

به این موضوع توجه کنید که هر دارو مدت زمان اثر متفاوتی دارد. بعضی داروها در مدت چند ساعت و برخی ديگر طی چند روز اثر خود را می گذارند. اين مدت زمان تقريبی را می توان از مقالات پيدا كرد. در غیر این صورت خود کاربر می تواند زمان های مختلفی را امتحان کند. (البته اگر زمان اضافی دارد!)

منابع

www.sigmaaldrich.com

“Why should I use XTT instead of MTT” (PDF, 0.1 MB). [aniara.com]. ANIARA. Retrieved 2010-11-19.

Stockert JC, Blázquez-Castro A, Cañete M, Horobin RW, Villanueva A (December 2012). “MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets”. Acta Histochemica. 114 (8): 785–96. doi:10.1016/j.acthis.2012.01.006. PMID 22341561.

Cory AH, Owen TC, Barltrop JA, Cory JG (July 1991). “Use of an aqueous soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth assays in culture”. Cancer Communications. 3 (7): 207–12. doi:10.3727/095535491820873191. PMID 1867954.