اسپکتروفتومتری (طیف سنجی نوری)

اسپكتروفتومتر چیست؟

به زبان ساده، اسپکتروفتومتر دستگاهی است که شدت نور را به صورت تابعی از طول موج اندازه گیری می کند. در این دستگاه تابش الکترومغناطیسی جذب ماده می شود و از روی شدت جذب هر ماده، مقدار ماده (غلظت ماده) تعیین می شود.

در اسپكتروفتومتری ميزان جذب يا عبور طول موج های مشخصی از نور فرودی از يک محلول حاوی نمونه مورد نظر اندازه گيری می شود. دستگاه اسپکتروفتومتر امکان اندازه گیری غلظت های فوق العاده کوچک را دارد. بنابراین در تجزیه و تحلیل عناصر مولکولی نظیر DNA و  RNA به کار می رود. از این رو بيشترين كاربرد آن در آزمايشگاه های بيوشيمی است.

تئوری اسپكتروفتومتری

مواد مختلف در برابر امواج الکترومغناطیسی رفتار متفاوتی دارند. به عبارتی هر ماده شیمیایی، میزان جذب متفاوتی در طول موج های مختلف انرژی الکترومغناطیسی دارد. وقتی مواد در برابر امواج الکترومغناطیسی قرار گیرند، هر ماده در طول موج خاصی حداکثر جذب و حداقل عبور را خواهد داشت.

از آن جایی که غلظت هر عنصر، در میزان جذب طول موج آن تاثیر دارد، از این پدیده برای تعیین غلظت و برخی خواص دیگر ماده استفاده می شود. با افزایش غلظت، میزان جذب در طول موج مشخص افزایش و با کاهش غلظت، میزان جذب کاهش و مقدار نور عبوری افزایش می یابد. تئوری اسپكتروفتومتری بر اساس قانون بیرلامبرت (Beer-Lambert law) بنا شده است:

Log(i/i₀) = A

که در این رابطه، I₀ شدت نور اولیه، I شدت نور عبوری و A مقدار جذب ماده را نشان می دهد. مقدار A را نیز می توان توسط رابطه زیر محاسبه کرد:

A = ɛbc

ɛ بیانگر ضریب جذب ماده است، b طول نمونه را نشان می دهد و c بیانگرغلظت آن است.

چگونه غلظت ماده با اسپکتروفتومتری تعیین می شود؟

در فرایند اسپکتروفتومتری با استفاده از رابطه ای که تاثیری که غلظت ماده و میزان جذب نور عبوری از آن دارند، می توان رابطه غلظت – جذب هر ماده شیمیایی را مشخص کرد. در واقع در اسپکتروفتومتری سوال اصلی این است که چه مقدار ماده شیمیایی نور را جذب کرده است؟

دستگاه های اسپکتروفتومتر دارای دو نوع منبع برای تولید نور هستند. لامپ های تنگستن یا هالوژن برای تولید نور مرئی و مادون قرمز با طول موج 320 تا 1100 نانومتر به کار می روند. برای تولید امواج فرابنفش نیز از لامپ دوتریوم با طول موج 190 تا 320 نانومتر استفاده می شود.

نور تولید شده توسط این لامپ ها با استفاده از مونوکروماتور (تک رنگ ساز) فیلتر می شود. سپس در طول مسیر با استفاده از چند منشور و توری پراش، طول موج خاصی انتخاب می شود و از شکاف عبور یا متمرکز کننده پرتو عبور می کند.

در ادامه این پرتوی نوری از نمونه عبور می کند. بخشی از نور در داخل نمونه جذب می شود و مابقی عبور می کند. نور عبوری به آشکارساز (Detector) رسیده و پس از تعیین شدت نور و تبدیل آن به انرژی الکتریکی، طیف ماده توسط صفحه نمایشگر نشان داده می شود.

نمونه سازی در اسپکتروفتومتری

قبل از این که وارد شرح اجزای دستگاه های اسپکتروفتومتری شویم، لازم است جزئیاتی در مورد نمونه های آزمون طیف سنجی بدانیم. برای اجرای این نوع طیف سنجی (به خصوص مرئی-فرا بنفش) لازم است نمونه کلوئیدی باشد.

مثلا فرض کنیم ما قصد آنالیز خواص نوری عنصر طلا را داریم. این عنصر باید در یک محلول (مثلا اتانول) به شکل یکنواخت پخش باشد. یعنی یک محلول کلوییدی داشته باشیم. آن مایعی که می خواهیم به عنوان زمینه کلوئید استفاده کنیم، باید قابلیت عبور نور در طول موج مشخصی که قصد آزمایش داریم، داشته باشد.

منظور از نمونه و مرجع در طیف سنجی نوری چیست؟

حال می خواهیم محلول فوق را آنالیز کنیم. اینجا باید بدانیم دستگاه اسپکتروفتومتر دو بخش را آنالیز می کند: یکی مرجع و دیگری نمونه. مرجع هر چیزی به غیر از خود عنصر است که برای آنالیز در دستگاه داریم. برای مثال، در مورد گفته شده، رفرنس اتانول است به علاوه ظرف آزمایش.

منظور از نمونه (Sample) خود ماده است به علاوه زمینه؛ یعنی طلا + اتانول + ظرف نمونه. دستگاه اسپکتروفتومتر شدتی از نور که از سمپل می گذرد را به شدتی که از رفرنس می گذرد، در طول موج های مختلف تقسیم می کند. به حاصل این تقسیم ها نسبت (Ratio) گفته می شود. با وصل کردن این نسبت ها به یکدیگر، طیف نهایی به دست می آید.

اجزای دستگاه اسپکتروفتومتر

منبع نور یا لامپ اسپکتروفتومتر

نقش منبع نور دستگاه اسپکتروفتومتر تولید انرژی تشعشعی است. لامپ های تنگستنی، محدوده طول موج گسترده ای را به شکل ممتد از خود منتشر می کنند. این طول موج ها برای اندازه گیری در مناطق مختلف الکترومغناطیس، به خصوص در منطقه مرئی و فرابنفش (از ۳۵۰ تا ۷۰۰ نانومتر) مورد استفاده قرار می گیرند.

در طول موج های پایین تر از ۳۴۰ نانومتر، پوشش شیشه ای فیلمان تنگستنی شروع به جذب نور می کند. از این رو لامپ تنگستنی برای اسپکتروفتومتری با طول موج های کمتر از ۳۵۰ نانومتر توصیه نمی شود. از آن جایی که طیف خارج شده از منبع نور با تغییر دما تغییر می کند، لازم است ولتاژ به طور دقیق تنظیم شود تا از عدم تغییر طیف نوری اطمینان حاصل شود.

سیستم کنترل ولتاژ

در این روش طیف سنجی، لازم است شدت نور خارج شده از لامپ ثابت باشد. مشخص است اگر ولتاژ برق ورودی به دستگاه تغییر کند، شدت نور لامپ نوسان پیدا می کند. از این رو لازم است تنظیم کننده ولتاژ در دستگاه اسپکتروفتومتر نصب شود.

امروزه با پیشرفت این دستگاه ها، خطای ناشی از تغییرات ولتاژ را می توان با کمک اسپکتروفتومتر دو شعاعی از بین برد. در این روش یک منبع نوری منفرد توسط آینه شکسته شده و سپس نور از دو  مونوکروماتور (تک فام ساز) عبور می کند.

نصف نور از محفظه (کووِت (cuvett)) رفرنس و نصف دیگر از کووت نمونه عبور می کند. نور خروجی از هر یک از این ها در یک تیوب Photomultiplier مجزا ارزیابی می گردد. سپس مفسر دستگاه اسپکتروفتومتر، علائم خروجی از هر آشکارساز را مقایسه می کند. نسبت دو علامت خروجی، نشانگر ولتاژ خروجی اصلی دستگاه است.

مونوکروماتور (Monochromator)

این بخش دستگاه طیف سنج، نور تولیدی توسط لامپ را به پرتوهای تک رنگ تبدیل می کند. این عمل معمولا توسط منشور یا سیستم های گریتینگ (Grating) اجرا شود. این فیلترهای مونوکروماتور شیشه های رنگی هستند که بخش وسیعی از پرتوها را جذب کرده و فقط طول موج های محدودی را از خود عبور می دهند.

پهنای شکاف مونوکروماتور تعیین کننده پهنای نور عبور یافته به کووت نمونه و رفرنس است. دستگاه اسپکتروفتومتر ساده پهنای شکاف ثابتی دارد. در دستگاه های اسپکتروفتومتر پیچیده، پهنای شکاف قابل تنظیم بوده و می توان نور عبور یافته را به صورت دستی انتخاب کرد.

سیستم گریتینگ (Grating)

این سیستم در مونوکروماتور، طیفی موازی یا خطی تولید می کند. این سیستم از صفحه ای صیقل داده شده با شکاف هایی موازی در فواصل نزدیک به یکدیگر ساخته شده است. با فرود نور به سیستم grating، طیف های بسیار ظریفی به ازاء هر یک از خطوط سیستم grating تشکیل می گردد.

طول موج های هم فاز همدیگر را تقویت کرده و غیر هم فازها یکدیگر را حذف و ناپدید می کنند. برای انتخاب طول موج دلخواه، منشور یا سیستم گریتینگ اسپکتروفتومتر تحت چرخش قرار می گیرد تا طول موج مناسب از شکاف به خارج هدایت شود. نور عبور یافته بر اساس پهنای آن مشخص می شود. این همان نوری است که از نمونه عبور می کند و طول موج آن برحسب نانومتر اندازه گیری می شود.

سیستم منشوری

منشور هایی که در روش های اسپکتروفتومتری به کار می روند، شیشه هایی با لبه‌ های تیز و به شکل هرمی هستند که به علت تفاوت در ضریب شکست، باعث تجزیه نور می شوند. به عبارت دیگر نور سفید ورودی به منشورها به درجات مختلفی پراکنده می شود. بر اساس طول‌ موج نور، نور قرمز کمتر از طیف ناحیه آبی یا بنفش شکسته می ‌شود. هر چه طول‌ موج نور ورودی کمتر باشد، شکست آن در منشور اسپکتروفتومتر بیشتر است.

آشکار ساز (Detector)

وظیفه آشکارساز دستگاه اسپکتروفتومتری تبدیل انرژی نورانی به الکتریکی است. این تبدیل متناسب با شدت نور فرودی به سطح حساس آن ها صورت می گیرد. فوتوسل های آشکارساز، ترکیبی از مواد حساس به نور هستند که به صورت لایه ای سطح خارجی آن ها پوشش داده شده است.

جهت فعال شدن فوتوسل نیازی به منبع ولتاژ خارجی نیست. در اثر برخورد نور به فوتوسل، جریانی از الکترون ها به طرف مدار خارجی به حرکت در می آیند. علاوه بر فوتوسل ها، از انواع فوتوتیوب نیز استفاده می شود. فوتوتیوب ها برای فعال شدن نیاز به یک منبع ولتاژ خارجی دارند.

در اثر تابش نور به فوتوتیوب، شدت بالایی از الکترون از کاتد خارج شده و در یک آند جذب کننده تجمع می یابد. این الکترون های جمع شده، از طریق مدار خارجی اندازه گیری می شوند. نوع ماده به کار رفته در ساخت کاتد، تعیین کننده حد طول موج هایی است که در آن فوتوتیوب حداکثر پاسخ را می دهد.

مفسر دستگاه اسپکتروفتومتر

نقش این بخش از دستگاه تفسیر انرژی الکتریکی خروجی از آشکارساز و نمایش داده ها به شکل قابل تفسیر برای کاربر است. به طور معمول داده ها به شکل نموداری که شدت نور را برحسب میزان جذب نور نمایش می دهند، ارائه می شوند.

بعضی دستگاه های اسپکتروفتومتر نیز داده ها را به طور مستقیم بر حسب واحد غلظت گزارش می کنند. بخش نمایش خروجی نیز می تواند یک گالوانومتر صفحه ثبات (اسیلوسکوپ (Oscilloscope)) یا صفحه نمایشگر کامپیوتر با نرم افزارهای متنوع باشد.

انواع روش های طیف سنجی نوری

طیف سنجی مرئی (Visible)

در اسپکتوفتومتری مرئی، جذب یا انتقال ماده می تواند به وسیله رنگ مشاهده شده ارزیابی شود. برای مثال، کلوئیدی که طیف نوری بالاتر از مرئی را عبور دهد و یا به عبارتی هیچ طول موج مرئی را عبور ندهد، با رنگ سیاه دیده می شود.

اگر این کلوئید تمام طول موج مرئی را عبور دهد و هیچ نوری را جذب نکند، نمونه محلول به رنگ سفید (شفاف) مشاهده می شود. در اسپکتوفتومتری مرئی برای تجزیه نور و به دست آوردن طیف معینی از طول موج، از منشور استفاده می شود. از این رو شعاع خاصی از نور، از نمونه کلوئیدی عبور می کند.

طیف سنجی مرئی-فرابنفش (UV-vis)

این طیف سنج ها پر مصرف ترین دستگاه های اسپکتروفتومتر در آزمایشگاه هستند. در این دستگاه های آنالیز پر کاربرد، با توجه به میزان عبور و جذب نور، غلظت مواد در یک نمونه با دقت بالایی تعیین می شود. این طیف سنج ها آنالیز مواد مختلف را در محدوده طول موج 190 تا ۳۳۰۰ نانومتر با دقت بالا ارائه می کنند.

در دستگاه طیف سنج مرئی- فرابنفش، بعد از عبور نور از محلول نمونه، نور باقی مانده به یک آشکارساز Photomultiplier و یا Photodiode وارد می شود. پس از پردازش کامپیوتری، درصد عبور نور و یا لگاریتم آن با عنوان عدد جذب نور در نمایشگر ظاهر می شود. محاسبات جذب یا عبور نور از قانون بیر-لامبرت پیروی می کنند.

عموما منابع نوری قابل استفاده در این دستگاه یک لامپ هالوژن تنگستن، برای نور مرئی و یک لامپ دوتریم برای نور  UVاست. کاربرد های اصلی این دستگاه عبارتند از:

آنالیز رنگی رنگ ها و منسوجات، محلول‌ های کدر، مطالعات سینتیکی آنزیمی در علوم زیستی، بیو‌شیمی و آزمایشگاه های دارویی، بررسی خواص نوری نانو مواد و ساختار های فوتوکاتالیستی و…

علاوه بر این موارد، طیف سنج فرابنفش  (Ultraviolet–visible spectroscopy) نیز وجود دارد که اساس کاری مانند اسپكتروفتومتر مرئی دارد. با این تفاوت که فقط به طول موج‌ های نور فرابنفش حساس است.‏

طیف سنجی مادون قرمز (IR)

در این دستگاه ها از طیف نور مادون قرمز استفاده می شود. اسپکتروفوتومتر مادون قرمز در شناسایی مولکولی و ارتعاشات وابسته به ساختار آن استفاده می شود.‌‌ ‌در این طیف سنج ها یک پرتو مادون قرمز مستقیما به نمونه تابانده می شود. تمام طول موج‌ های طیف نسبت به پرتوی مرجع اندازه‌ گیری می‌شوند.

به منظور تولید طیف مادون قرمز با کیفیت بالا، باید پهنای طیف ورودی به آرامی اسکن شود. اسپکتروسکوپی ‌IR با روش بسط تبدیل فوریه اصلاح می شود که به آن آنالیز FTIR می گویند. کارایی‌FTIR  از دستگاه‌های معمولی مادون قرمز بیشتر است. در این روش آنالیز می ‌توان تنها با مقدار کمی از نمونه و در زمانی کوتاه به طیفی عالی دست یافت.

طیف سنجی نشر شعله (‏‎(Flame

ساختار اين دستگاه شبيه اسپكتروفتومتر يا فوتومتر ساده است. با اين تفاوت كه در فوتومترهای معمولی، لامپ الكتريكی و در اين دستگاه نور حاصل از سوختن ماده مورد آزمايش در درون شعله به عنوان منبع نوری در نظر گرفته می ‌شود. در طيف سنجی نشر شعله، نور حاصل مستقيما ارزیابی می گردد.

طیف سنجی جذب اتمی (‏‎Atomic Absorption)

اسپكتروفتومترهای جذب اتمی ‏‎(AAS)‎‏ معمولا غلظت عناصر فلزی كه از لحاظ پزشكی برای حفظ سلامتی مهم است را اندازه گيری می كنند. در خصوص اين عناصر می ‌توان به كلسيم، منيزيم، مس، روی و آهن اشاره نمود. در اسپكتروفتومتری جذب اتمی نور از يک منبع مناسب تولید می شود و از سيستم تک رنگ كننده به يک آشكار ساز انتقال می یابد. از آن جا که هر اتم طول موج خاصی را جذب می کند، باید برای اندازه گیری هر عنصر منبع نور همان عنصر استفاده شود.

از طیف سنجی نوری در چه مواردی استفاده می شود؟

امروزه از روش های طیف سنجی در اکثر تحقیقات استفاده می شود. پژوهش های حوزه شیمی، متالورژی و الکترونیک نیاز به این دستگاه دارند. اما کاربردهای بیولوژیکی و پزشکی اسپکتروفتومتری در بین کاربردهای آن است.

قند خون، انواع چربی ها، اسید اوریک، اوره و غیره از جمله موادی هستند که باعث بروز بیماری های مختلفی برای افراد می شوند. اندازه گیری غلظت این مواد توسط اسپکتروفوتومتر امکان پذیر است.

علاوه بر زمینه های پزشکی، این دستگاه برای اندازه گیری غلظت مواد رنگی محلول هانیز کاربرد دارد. تعیین غلظت مواد، اندازه گیری فعالیت اکثر آنزیم ‌ها، تری گلیسیرید، کلسترول، لیپو پروتئین ‌ها، قند، کراتینین و… با انواع طیف سنج ها امکان پذیر است.

بررسی ساختمان مولکولی مواد و ترکیبات، شناسائی ترکیبات ناشناخته، مقایسه ساختارهای‌ مختلف، یافتن طول موج ماکزیمم جذب و… از دیگر کاربردهای کیفی اسپکتروفتومتری در مباحث تحقیقاتی است.

نکات ایمنی در هنگام استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر

• بهتر است دستگاه اسپکتروفتومتر روی سطحی صاف و بدون شیب و بالاتر از سطح زمین قرار گیرد.
• به هیچ وجه این دستگاه نباید در نزدیکی دستگاه هایی که امواج الکترومغناطیس و امواج الکتریکی شدید تولید می کنند، قرار گیرد. وگرنه ممکن است در نتایج آنالیز خطا به وجود آید.
• در هنگام راه اندازی دستگاه اسپکتروفتومتری و وصل آن به برق، باید از UPS یا ثابت کننده جریان و محافظ برق استفاده کرد.
• بعد از روشن شدن دستگاه، حداقل زمان لازم برای پایداری دستگاه 15 دقیقه است. پس از این مدت، دستگاه گرم شده و به پایداری حرارتی و الکترونیکی می رسد، یعنی برای کاربری های مختلف آماده است.
• از آغشتگی سل هولدر و دستگاه به نمونه خودداری کنید. همچنین پس از استفاده از دستگاه، باید دستگاه و سل های مربوطه را تمیز کنید و روی دستگاه کاور بکشید.
• حتی الامکان اسپکتروفتومتر را از جای خود حرکت ندهید و دقت داشته باشید به آن ضربه ای وارد نگردد.
• سالی دو بار بدنه دستگاه باز کنید و گرد و غبار درون دستگاه تمیز کنید.
• لامپ اسپکتروفتومتر با Lens paper مخصوص را ماهی یک بار تمیز کنید.
• به هیچ وجه نباید دست کاربرد با لامپ تماس پیدا کند. چون طول موج اشتباهی تولید خواهد شد.
• مسیر کووت‌ ها و شیارهای مونوکروماتور در فواصل هفتگی تمیز شوند.