آنالیز DLS (پراکندگی نور دینامیکی)

اندازه مواد و ذرات آن ها از مهم ترین خواصی است که از گذشته تاکنون همواره مورد بررسی و آزمون قرار گرفته است. در عصر حاضر این عامل در علم فناوری نانو به بحث روز تبدیل شده و در جهان به سرعت در حال پیشرفت است.

یکی از روش هایی که با بهره گیری از آن می توان توزیع اندازه ذرات (حتی در ابعاد نانو) به دست آورد، روش پراکندگی نور دینامیکی یا تفرق نور پویا است که به اختصار به آن DLS گفته می شود. اساس عملکرد آنالیز DLS ، حرکت براونی ذرات معلق در فاز مایع است.

نمونه هایی که با این تکنیک مورد آزمون قرار گیرند، لازم است به صورت سوسپانسیون یا امولسیون باشند. دستگاه های متنوعی نیز توسط شرکت های مختلف دنیا برای اندازه گیری و اجرای این آزمون ساخته شده است.

ساز و کار اصلی همه این دستگاه ها یکسان است و فقط در بعضی از اجزای جانبی تفاوت دارند. در این مقاله، سعی می کنیم پس از معرفی تست DLS و تئوری آن، اساس کار و کاربردهای آن را مورد بررسی قرار دهیم.

آنالیز DLS چیست؟

آنالیز DLS روشی فیزیکی برای تعیین توزیع ذرات موجود در محلول ها و سوسپانسیون ها است. در این روش پس از برهمکنش نور لیزر با ذره، پراکندگی و تغییرات شدت نور بر حسب حرکات براونی ذرات، ارزیابی شده و بر اساس آن توزیع ابعاد ذرات محاسبه می گردد.

به دلیل حرکت ذرات و برهمکنش آن ها با محیط مایع، شدت پراکندگی نور بر حسب زمان و در زوایای مختلف متغیر است. از همبستگی موجود بین این تغییرات و پارامترهای کلوئید، می توان اندازه ذرات را محاسبه کرد.

به عبارت دیگر اندازه‌ گیری حرکت براونی ذرات در تست DLS، از طریق محاسبه میزان نوسانات شدت پرتوهای نور متفرق شده توسط ذرات کوچک و بزرگ مشخص می شود. این تشخیص، از روی تغییرات الگوی نقطه ‌ای که به صورت کم‌ نور شدن و یا پر ‌نور شدن نقاط تیره و روشن است، انجام می گیرد. تعیین شدت تفرق پرتوهای نور، به اندازه‌ گیری ذرات منتهی می ‌شود.

نقش پتانسیل زتا در تست DLS

درک ارتباط میان اندازه گیری ذرات و پتانسیل آن ها، به پتانسیل جریان سیال زتا منجر می شود. این پتانسیل نشان دهنده میزان مقاومت الکترواستاتیکی بین ذرات است. یکی از آزمون هایی که معمولا با دستگاه DLS قابل اجراست، تعیین پتانسیل زتای ذرات است.

پتانسیل زتا در اغلب موارد به عنوان شاخصی برای بررسی پایداری پراکندگی نمونه به کار می رود. پتناسیل زتای بالا از نظر اندازه به این معناست که سوسپانسون از نظر پایداری الکتروستاتیکی در وضعیت مطلوبی است.

این پارامتر به عنوان تابعی از PH و عاملی در تغییر شیمیایی نمونه، برای ایجاد فرمولاسیون های جدید و موادی با پایداری بیشتر به کار می رود. مشخص کردن نقطه ای که پتانسیل زتا در آن صفر است (نقطه ایزوالکتریک)، شرایط بهینه را برای جداسازی ذرات و یا در مقابل ایجاد لخته، فراهم می کند.

حرکت براونی ذرات در آزمون DLS

وقتی ذرات مختلف درون محلول های پخش کننده (Dispersant) قرار می گیرند، مولکول های محلول به ذرات نیرو وارد می کنند. به حرکت تصادفی ذرات درون محلول پخش کننده که بر اثر اعمال نیرو از سوی مولکول های محلول ناشی شود، حرکت براونی (Brownian Motion) می گویند.

اندازه گیری حرکت براونی ذرات در آنالیز DLS با استفاده از دستگاه DLS و تابش پرتوهای مرئی از یک منبع نور از جنس نئون–  هلیوم با طول موج 633 نانومتر انجام می گیرد. حرکت براونی ذرات درون محلول پخش کننده، وابسته به اندازه ذرات است. هر چه اندازه ذره درون محلول بزرگ تر باشد، حرکت براونی ذره آهسته تر شده و به همین ترتیب، با کوچک تر شدن اندازه ذره، حرکت آن درون محلول پخش کننده سرعت بیشتری خواهد داشت.

حرکت براونی ذرات به عوامل دیگری مانند دما و ویسکوزیته نیز بستگی دارد. بنابراین ضروری است که عوامل تأثیرگذار در اجرای آزمون کاملا ثابت باشند. در غیر این صورت، آزمون انجام شده دارای خطا خواهد بود.

آنالیز DLS به چه صورتی اجرا می شود؟

هر ذره در سوسپانسیون، دائماً به طور مستقل از ذرات دیگر حرکت می کند. این تحرک در آنالیز DLS نقش مهمی ایفا می کند. در دمای ثابت، ذراتی با ابعاد بزرگتر بسیار آهسته ‌تر حرکت می ‌کنند. وقتی اشعه لیزر با فرکانسی معین به ذرات متحرک برخورد کند، با فرکانسی متفاوت پراکنده می شود و در فاز نور پخش شده نوسان ایجاد می‌ شود. به این پدیده اثر داپلر (Doppler effect) می گویند.

میزان تغییر در بسامد نور پخش شده با اندازه ذرات مرتبط است. به این صورت که در سرعت های متوسط بیشتر، ذرات کوچک ‌تر تغییر بیشتری در فرکانس نور به وجود می آورند. رابطه بین اندازه ذره و سرعت حرکت براونی آن، به ضریب نفوذ ذره نیز وابسته است.

تداخل پرتوهای پراکنده شده از ذرات مختلف، امواج تداخلی را به وجود می آورد که به وسیله آشکارساز ثبت می شود. از روی بررسی این امواج در دستگاه آنالیز DLS، ضریب نفوذ ذرات و در نتیجه اندازه ذرات محاسبه می شود.

جهت آشنایی بیشتر با مفاهیم گفته شده، فیلم کوتاهی از اجرای این تست به صورت عملی تهیه شده است که پیشنهاد می کنیم آن را مشاهده کنید.

یک دستگاه تست DLS متشکل از اجزای زیر است:

منبع نور

یکی از قسمت های مهم دستگاه، منبع نور لیزر است که وظیفه آن تولید نور مورد نیاز برای تابش بر نمونه آزمایش است. در این روش، از منابع لیزر متعددی می تواند استفاده شود. نوری که از منبع نور لیزر دستگاه تابیده می شود، قبل از رسیدن به نمونه، باید از قسمتی به نام تضعیف کننده (Attenuator) عبور کند.

تضعیف کننده

تضعیف کننده باید این قابلیت را داشته باشد که میزان شدت نور تابیده شده از منبع را با توجه به نوع نمونه مورد آزمایش تضعیف کند. تضعیف کننده های مدرن، می توانند میزان نور تابیده شده را بر حسب درصد تابش از 0.0003 درصد تا 100 درصد تابش تغییر دهند.

نقش تضعیف کننده زمانی مشخص می شود که شدت نور پراکنده شده از نمونه زیاد باشد. در این حالت انجام آزمایش ممکن نیست. مثلا نمونه هایی که غلظت بالایی دارند و یا نمونه هایی که میزان تفرق نور در آنها بالا است.

همچنین در مواقعی که میزان تفرق نور کمتر از حد نیاز باشد، تضعیف کننده می تواند با کاهش شدت نور تابیده شده به اندازه مناسب و بهینه کردن مقدار شدت نور متفرق شده از نمونه، شرایط را برای انجام تست DLS در وضعیت ایده آل فراهم کند.

کووت (Cuvette)

نور تابیده شده از منبع لیزر، پس از عبور از تضعیف کننده با نمونه مورد آزمایش که به حالت سوسپانسیون و یا امولسیون درون کووت تزریق شده است، برخورد می کند. کووت یا سل، یکی از اجزای دستگاه DLS است که نمونه درون آن ریخته می شود. یعنی نمونه در این مکان قرار می گیرد. اکثر نوری که به کووت می رسد، بدون تغییر جهت به طور مستقیم عبور می کند.

شناساگر

بخشی از نوری که به نمونه آزمایشی می رسد و از آن عبور نمی کند، در اثر برخورد با ذرات نمونه آزمایش متفرق می شود. نور متفرق شده با زاویه 173 درجه توسط شناساگر که یکی دیگر از اجزای دستگاه است، دریافت می شود. وظیفه شناساگر اندازه گیری و ثبت شدت تفرق نور است. در واقع الگوی نقطه ای تست DLS با استفاده از شناساگر به دست می آید.

ارتباط سنج

سیگنالِ شدتِ تفرق که به شکل الگوی نقطه ای در شناساگر ثبت شده است، به ارتباط سنج ارسال می شود. ارتباط سنج هم با مقایسه شدت تفرق در محدوده های مختلف زمانی، نرخ اختلاف شدت را در زمان های مختلف محاسبه می کند.

رایانه

اطلاعات به دست آمده با استفاده از ارتباط سنج، به رایانه انتقال داده می شوند. رایانه با نرم افزار مخصوص، داده های ارسالی را آنالیز می کند. در آخر اطلاعات مورد نیاز به صورت توزیع اندازه ذرات نمایش داده می شوند.

برای ساخت نمونه موفق، به موارد زیر توجه داشته باشید …

امروزه اکثر متقاضیان تست DLS برای بررسی نانوذرات به سراغ این روش می روند. این نانوذرات باید در یک حلال مناسب (ترجیحا غیر از استون) حل شوند تا به غلظت مورد نظر برسند. در صورت نیاز، لازم است با کمک گرفتن از دستگاه التراسونیک، نمونه به صورت سوسپانسیون آماده آزمایش شود و با حجم حداقل 2 تا 5 میلی لیتر به آزمایشگاه تحویل داده شود.

معمولا روش کار به این صورت است که متقاضیان اگر مراحل آماده سازی نمونه را به آزمایشگاه واگذار کنند، حدود 30 درصد تعرفه آزمون DLS دریافت خواهد شد. در ضمن متقاضی باید ضریب شکست نانوذره مورد نظر و همین طور ضریب شکست و ویسکوزیته در دمای مشخصی که برای حلال انتخاب شده را نیز به آزمایشگاه ارائه کند.

نمونه تست DLS نباید کاملا تیره و کدر باشد تا پرتوی لیزر از آن عبور کند. لازم به ذکر است معمولا امکان انجام آزمون DLS با محلول‌ های خورنده ، pHهای بسیار اسیدی یا قلیایی فراهم نیست.

نتایج آزمایش DLS

داده های آنالیز DLS معمولا به سه صورت شدت (Intensity)، حجم و تعداد گزارش می شوند. در نمودار شدتی، شدت پراکندگی نور از ذرات جامد گزارش می شود. طبق گزارشات تجربی، میزان پراکندگی نور، حدودا با توان ۶ اندازه ذرات متناسب است. بنابراین در نمودار شدتی، ذرات بزرگتر پیک بسیار بزرگتری نسبت به ذرات کوچک تر دارند.

در نمودار حجمی، حجم ذرات با اندازه های مختلف نمایش داده می شوند. در این نمودار نسبت حجمی ذرات با ابعاد مختلف قابل مقایسه هستند. حجم ذرات تقریبا با توان ۳ اندازه آن ‌ها متناسب است.

نمودار تعدادی هم نشان دهنده توزیع اندازه ذرات است که کاربردی ترین و متداول ترین داده مورد استفاده در آنالیز DLS است. نکته مهم در نتایج آزمایش DLS این است که نرم افزار دستگاه، ذرات را به صورت کره فرض می کند.

از این رو اگر ذرات مورد آزمایش به شکل کره نباشند، نتیجه آزمون DLS دقت کاملی نخواهد داشت. به این نکته توجه کنید که اگر ذرات به صورت میله یا صفحه باشند، نتایج DLS دقت چندانی ندارد و ممکن است توزیع اندازه پهن شود و یا چند پیک توزیع اندازه در نتایج دیده شود.

یک مثال کاربردی

یک روش ساده برای توصیف تفاوت نمودارهای حجم، شدت و تعداد، استناد به آنالیزی از ذرات کروی به قطرهای ۵۰ نانومتر و ۵ نانومتر حاضر در تعداد برابر است. در نمودار توزیع عددی از این دو توده ذرات، نموداری حاوی دو قله (که در ۵ و ۵۰ نانومتر) با نسبت ۱: ۱ بدست می ‌آید. اگر این توزیع به حجم تبدیل شود، دو قله به نسبت ۱: ۱۰۰۰ نتیجه خواهد شد (به دلیل فرمول محاسبه حجم کره). اگر به توزیع شدتی استخراج شود، نسبت ۱: ۱۰۰۰۰۰۰ بین دو قله به دست خواهد آمد (به این دلیل که شدت پراکنش متناسب با قطر به توان 6 است).

محتویات نتیجه آنالیز DLS

در اکثر مراکزی که دارای دستگاه تست DLS باشند، نتایج ارسالی به پژوهشگر شامل دو فایل PDF و اکسل است. فایل اکسل شامل داده های روش تحلیلی SBL بر حسب شدت ، تعداد ذرات و حجم برای این آنالیز است. فایل پی دی اف که ارائه می شود دارای اهمیت بیشتری است که در ادامه بخش های آن را بررسی می کنیم.

قسمت اول: مشخصات آنالیز DLS

این قسمت شامل مشخصات دستگاه و خصوصیات نمونه است اصطلاحات آن در ادامه تعریف می شود.

• Time interval: به معنی فاصله زمانی است. هرچه نمونه رقیق تر باشد این مقدار بیشتر است. مقدار معمول این پارامتر بین 1 تا 160 است. این مقدار توسط اپراتور تعیین می شود.
• Number of channels: تعداد کانال های دستگاه آزمایش DLS است. هرچه توزیع ذرات در گستره بیشتری باشد، این مقدار بیشتر می شود.
• Laser power: قدرت لیزر است که توسط اپراتور تعیین می گردد. هر چه نمونه غلیظ تر باشد، این مقدار کمتر می شود. اغلب اوقات این مقدار به شکل درصد اعلام می شود.
• Wavelength: طول موج دستگاه است که به صورت ثابت 657 نانومتر است.
• DTC Position: موقعیت مکانی قرارگیری منشور دستگاه نسبت به نمونه است. این پارامتر به دو صورت پایین و بالا قابل تغییر است و بیشتر برای نمونه های ژلی یا خیلی رقیق کاربرد دارد. وضعیت پایین برای نمونه های ژل شده است.
• Angle: زاویه تابش نور لیزر به نمونه است که به صورت ثابت 135 درجه در نظر گرفته شده است.
• Refractive index: میزان شکست نور نمونه است.
• Viscosity: بیانگر گرانروی (ویسکوزیته) نمونه است.

قسمت دوم: تحلیل آزمایش DLS

به طور کلی سه نوع تحلیل متداول برای نتایج آزمون DLS وجود دارد:

• :Pade Laplace این تحلیل بیشتر مصرف صنعتی دارد و اثر کلی ذرات را نشان می دهد و شامل نمودار های ستونی است.
• Cumulants: این روش یک روش تحلیل رایج است که بیشتر برای تحلیل نمونه های با ابعادی بیش از 200 نانومتر به کار می رود. معمولا به صورت نمودار توزیع و فراوانی، ابعاد هیدرودینامیکی ذره های تشکیل دهنده نمونه را نشان می دهد. برای تحلیل واقعیت گرایانه نمونه های دارویی این روش کاربرد بیشتری دارد.
• SBL: در این روش سعی می شود خطای آگلومراسیون کمتر شود و ابعاد ارائه شده به اندازه حقیقی ذرات نزدیک تر باشد. این تحلیل به نتایج حاصل از میکروسکوپ TEM نزدیک تر است.

برتری تست DLS نسبت به TEM در اندازه گیری ذرات

آنالیز DLS در اندازه گیری اندازه ذرات مزایای زیر را نسبت به میکروسکوپ TEM دارد (تکرار می کنیم در اندازه گیری اندازه ذرات!)

• در آزمایش DLS شدت به طور مستقیم با توان ششم اندازه ذرات متناسب است و مقیاس بندی دیگری نیاز ندارد.
• بر خلاف روش های تصویربرداری که ابتدا باید تصویر تهیه و ذرات شمرده شوند و در نهایت توزیع اندازه ذرات را به دست آورد، در آنالیز DLS به طور مستقیم توزیع اندازه ذرات گزارش می شوند.
• آزمون DLS روشی غیرمخرب و سریع است.
• روش DLS نمونه برداری مناسب تری دارد. زیرا حجم زیادی از نمونه آنالیز می شود و نتایج به دست آمده قابل اعتمادتر است.

مزایای تست DLS

• آنالیز ذرات با اندازه های کوچک حتی 1 نانومتر
• سرعت بالای آزمایش
• تکرارپذیری و قابل اطمینان بودن نتایج
• عدم نیاز به آماده سازی دشوار
• نیاز به حجم کم نمونه
• قابلیت آنالیز نمونه های رقیق
• قیمت مناسب

معایب تست DLS

• دشوار بودن تحلیل نتایج آنالیز
• مناسب نبودن برای محلول های با وزن مولکولی بسیار پایین
• مناسب نبودن برای سیستم مولکولی با خاصیت جذب بالا
• تحت تاثیر قرار گرفتن نتایج آزمایش در نتیجه آگلومراسیون ذرات
• خطا در نتیجه در صورت پراکندگی های چندگانه از نمونه

کاربردهای آنالیز DLS

• یافتن میانگین اندازه ذرات در مایعات
• مشخص کردن توزیع اندازه ذرات
• تحلیل رفتار ذرات در مایعات و تمایل آگلومراسیون در آن ها
• بررسی فعالیت داروها در محیط مایعات بدنی
• مطالعه کمی فرآیندهای پلی پپتیدها یا DNA
• بررسی پایداری کلوئیدی، تجمع و ترسیب در پیش ماده ها
• بررسی توزیع اندازه ذرات در دوغاب‌ ها
• اندازه ‌گیری پتانسیل زتا

منابع

Zetasizer Nano User Manual MAN0317 Issue 4.0 May 2008
R. Pecora, “Dynamic Light Scattering: Applications of Photon Correlation Spectroscopy”, springer 1985.
G.Merkus, “Particle Size Measurements: Fundamentals, Practice, Quality”, Springer, 2009.
B. Akbari1, M. Pirhadi Tavandashti, and M. Zandrahimi, “Particle Size Characterization of Nanoparticles- a Practical Application”, Iranian Journal of Materials Science & Engineering, 8, 2, (2011).
www.wikipedia.com